当前位置:首页 > 技术文章

技术文章

西部马脑脊髓炎病毒PCR检测试剂盒
点击次数:536 更新时间:2020-10-08

西部马脑脊髓炎病毒PCR检测试剂盒反应流程常规程序

将PCR反应所需的成分配置完后,在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟,使模板DNA充分变性,然后进入扩增循环。在每一个循环中,先于94℃保持30秒钟使模板变性,然后将温度降到复性温度(一般50-60℃之间),一般保持30秒钟,使引物与模板充分退火;在72℃保持分钟(扩增kb片段),使引物在模板上延伸,合成DNA,完成一个循环。重复这样的循环25~35次,使扩增的DNA段大量累积。后,在72℃保持3-7min,使产物延伸完整,4℃保存。

2.复性(退火)和延伸温度

复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素,通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高,可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度,变成二步法PCR。

3.反应时间

变性步骤一般使用30秒钟,如果模板的G+C含量较高,或直接用细胞做模板,变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定,一般采用kb用分钟来保证充足的时间。

4.循环次数

循环次数主要与模板的起始数量有关,在模板拷贝数为04~05数量级时,循环数通常为25~35次。

平台效应(plateaueffect):PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因:底物和引物的浓度已经降低,dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低,产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用,非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用,扩增产物自身复性,高浓度扩增产物变性不*。

5.PCR反应液的配制

PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样,在后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子,要求在反应液上覆盖一层矿物油,防止水分蒸发。

分享到:

加入收藏 | 返回列表 | 返回顶部

©2024上海谷研实业有限公司 版权所有  总访问量:257507 Design By 环保在线 
主营:补体片断5aElisa试剂盒,花生四烯酸Elisa试剂盒,维生素DElisa试剂盒 GoogleSitemap   备案号:沪ICP备12048703号-8

联系人: 马先生
电话:
021-39921927,021-39596320
手机:
15026555973
点击这里给我发消息
点击这里给我发消息
 

环保在线

推荐收藏该企业网站